Fundamentos da Engenharia Genética

A Engenharia Genética permite manipular directamente os genes de determinados organismos com objectivos práticos.

Tecnologia de DNA recombinante

• Permite combinar na mesma molécula de DNA genes provenientes de fontes diferentes, mas não necessariamente de espécies diferentes, dando origem a uma molécula de DNA recombinante (DNAr).
• Baseia-se na utilização de ferramentas moleculares como as enzimas de restrição, as ligases do DNA e os vectores.
  • Enzimas de restrição – reconhecem determinadas sequências de DNA e cortam a molécula nesses locais. As zonas de restrição correspondem a sequências de DNA curtas e simétricas que se lêem da mesma forma nas duas cadeias na direcção 5'-3'.

• As enzimas de restrição são bastante específicas e ocorrem naturalmente em bactérias. Protegem as bactérias dos ataques dos vírus, uma vez que reconhecem e cortam sequências específicas do DNA viral, inactivando-o. O DNA bacteriano está protegido da actividade das enzimas de restrição.
• A actividade das enzimas de restrição dá origem a fragmentos de DNA em dupla hélice – fragmentos de restrição - com extremidades em cadeia simples – extremidades coesivas.
• Verifica-se complementaridade de bases do DNA nas extremidades coesivas de diferentes fragmentos de restrição obtidos com a mesma enzima.

• As extremidades coesivas emparelham através de ligaçõe sde hidrogénio entre bases complementares e podem unir-se pela actividade de ligases do DNA que catalizam a formação de ligações fosfodiéster.
• Vector – entidade, constituída por DNA, que transfere o DNA de uma célula ou de um organismo dador para uma célula ou um organismo receptor.

• Os vectores mais utilizados são os plasmídeos e os bacteriófagos.
• Os plasmídeos são pequenas moléculas circulares de DNA que ocorrem naturalmente em algumas bactérias, leveduras e células vegetais.
• Os plasmídeos ligam-se a determinados compostos, tornando-os mais densos, permitindo a sua separação por centrifugação.

• Processo de obtenção e expressão de uma molécula de DNAr:

1. Selecciona-se uma molécula de DNA dadora, contendo o gene com interesse que se pretende transferir e clonar, e um vector adequado.
2. A molécula de DNA e o vector são tratados com a mesma enzima de restrição, que corta as duas moléculas em regiões com a mesma sequência de nucleótidos.
3. Misturam-se os fragmentos de restrição da molécula de DNA e o vector e juntam-se ligases do DNA. O vector e os fragmentos de restrição emparelham pelas extremidades coesivas, que são complementares, e a ligase estabelece a ligação.
4. O vector, contendo o DNA dador, é transferido para uma célula ou organismo receptor.
5. O DNA dador é incorporado no genoma da célula ou organismo receptor, que passa a possuir um DNA recombinante.
6. Um meio selectivo ou testes químicos permitem identificar as células que exprimem o gene desejado. No processo descrito formam-se fragmentos de restrição que não têm o gene desejado e nem todas as células receptoras incorporam o DNA dador.

DNA Complementar - DNAc

• Os procariontes são organismos muito utilizados em Engenharia Genética como receptores de DNA estranho porque são fáceis de cultivar, têm um crescimento rápido e processos bioquímicos bem conhecidos. No entanto, não processam o RNAm e, quando recebem genes com intrões, estes não são retirados e a proteína produzida não é funcional.
• DNA complementar (DNAc) – molécula de DNA sem intrões que é directamente transcrita numa molécula de RNAm funcional. O processo de obtenção de DNAc é o seguinte:

1. Isola-se uma molécula RNAm funcional das células.
2. Adiciona-se transcriptase reversa e nucleótidos livres. A transcriptase reversa catalisa a síntese de uma cadeia simples de DNA a partir de um molde de RNAm.
3. Junta-se uma enzima que degrada o RNAm que serviu de molde e DNA polimerase que catalisa a formação da cadeia complementar do DNA.

• O DNAc pode ser inserido através de um vector contendo o promotor e sequências reguladoras.
• Todos os DNAc que se sintetizam a partir do RNA podem ser clonados em bactérias, originando uma biblioteca de DNAc, em que toda a informação (genes que se encontravam a ser transcritos – expressos – num dado momento), fica armazenada em bactérias por longos períodos de tempo, desde que sejam fornecidas todas as condições indispensáveis para a sua manutenção.

Reacção de Polimerização em Cadeia – PCR

• Técnica que permite amplificar qualquer porção de DNA fora das células.
• Material necessário:
  • sequências de DNA que se pretende amplificar;
  • um par de iniciadores (primers);
  • os quatro tipos de nucleótidos;
  • uma polimerase DNA (Taq);
  • solução-tampão que impeça variações de pH e que contenha Mg² , ião essencial para a actividade da polimerase.
• Uma reacção de PCR corresponde a um conjunto de ciclos, envolvendo cada um destes ciclos:
  • Desnaturação da dupla hélice – é conseguida com a incubação do DNA a uma temperatura de 95°C, formando duas cadeias simples a partir de uma dupla cadeia;
  • Emparelhamento dos iniciadores – diminuição da temperatura aproximadamente para os 55°C, para ocorrer a ligação dos primers;
  • Polimerização (síntese) de DNA – ocorre a 70°C, temperatura óptima de actividade da Taq polimerase. Esta liga-se na região dos iniciadores, e promove a polimerização, com elongação da cadeia de DNA, servindo a outra como molde.
    
    
  • Este ciclo é repetido dezenas de vezes, para obter milhões de cópias de DNA, em poucas horas e sem intervenção manual. No final, leva à produção de 2^n moléculas de DNA de interesse, em que n representa o número de ciclos.
  • A Taq polimerase é uma polimerase extraída da Thermus aquaticus, uma bactéria que habita fontes termais com água extremamente quente, resistindo às variações de temperatura e contribuindo significativamente para o sucesso da técnica de PCR (o aquecimento para desnaturar as cadeias de DNA provocava a inactivação definitiva da polimerase, obrigando a adicionar mais enzima por ciclo de aquecimento).
• Um dos aspectos mais negativos desta técnica é a grande sensibilidade ``a contaminação com DNA estranho, podendo ocorrer emparelhamento entre os iniciadores e este DNA estranho, amplificando sequências não pretendidas.

DNA Fingerprint

• No genoma humano existem sequências de DNA repetitivas que são reconhecidas e cortadas por determinadas enzimas de restrição. Estas enzimas dividem o DNA em fragmentos cujas dimensões e composição em nucleótidos variam de pessoa para pessoa e reflectem as diferenças entre os alelos dos vários loci.
• Diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo diferente quando submetidos a electroforese (técnica em que determinadas moléculas são sujeitas à acção de um campo eléctrico num meio poroso) e o resultado é um padrão de bandas que difere de indivíduo para indivíduo.

Aplicações das Técnicas de Engenharia Genética

• DNA recombinante(DNAr):
  • Investigação fundamental: torna possível isolar genes de organismos complexos e estudar as suas funções a nível molecular.
  • Obtenção de OGM: os OGM são organismos em cujo genoma foram introduzidos genes que conferem características vantajosas. Os OGM
    • Os animais transgénicos, normalmente, são produzidos através de microinjecção de DNA de um determinado gene em células de um ovo fertilizado, ou através de células colocadas no útero de uma fêmea, decorrendo assim o seu desenvolvimento.
    • Os OGM são utilizados para:
      • produção de alimentos em maior quantidade e qualidade;
      • produção de grandes quantidades de substâncias com aplicação médica ou farmacêutica, como a insulina, hormona do crescimento ou factores de coagulação sanguínea;
      • produção de substâncias com aplicação industrial;
      • biorremediação – modificação de organismos no sentido de degradarem poluentes.
    
    
• DNA complementar (DNAc):
  • Obtenção de cópias de genes que codificam produtos com interesse – torna possível a produção de proteínas humanas por procariontes que podem ser cultivados facilmente em biorreactores.

• PCR:
  • Obtenção de grandes quantidades de DNA em pouco tempo, a partir de uma quantidade muito pequena. Esse DNA pode ser posteriormente utilizado em técnicas de recombinação de DNA ou em fingerprint.

• DNA fingerprint:
  • Investigação criminal, forense e histórica – a técnica permite partir de material biológico deixado num local (cabelo, sangue, esperma...) e compará-lo com o dos suspeitos; permite a identificação de cadáveres.
  • Determinação de paternidade – a comparação das impressões digitais genéticas dos progenitores e do descendente permite excluir a paternidade ou confirmá-la com um elevado grau de certeza.

• Há alguns obstáculos na expressão de genes eucariontes em bactérias.
  • Deve associar-se o gene às sequências promotoras e reguladoras mais apropriadas e que possam ser reconhecidas pela RNA polimerase da bactéria (as zonas de regulação da expressão génica em procariontes são diferentes dos eucariontes).
    • A resolução deste problema pode ser obtida pela combinação de uma determinada sequência nucleotídica com um promotor da própria bactéria, permitindo a expressão da sequência eucarionte inserida.
  • Quando se transferem genes para uma bactéria, é aconselhável que o DNA transferido já esteja processado, uma vez que as bactérias hospedeiras não possuem enzimas para o processamento e remoção dos intrões, introduzindo uma cópia de DNAc do gene.

• A utilização e introdução no mercado dos OGM é um assunto controverso e que levanta problemas éticos. Apesar das vantagens associadas a estes organismos, o impacto que podem vir a ter sobre o ambiente e a saúde humana é desconhecido e imprevisível.